Analizador De Elisa

Posteado: 20/10/2010 |Comentarios: 0 | Vistas: 1,922 |

PROPÓSITO DEL ANALIZADOR DE ELISA

El analizador de ELISA se utiliza para leer el resultado de las pruebas efectuadas, utilizando la técnica de ELISA, la cual tiene aplicación directa en inmunología y en serología; permite confirmar la presencia en el organismo de anticuerpos o antígenos de un agente infeccioso, vacunal o autoanticuerpos –artritis reumatoide, por ejemplo–, entre otras aplicaciones.

PRINCIPIOS DE OPERACIÓN

El analizador de ELISA es un espectrofotómetro especializado. A diferencia de los espectrofotómetros convencionales que permiten efectuar lecturas en un rango amplio de longitudes de onda, este dispone de filtros o rejillas de difracción que limitan el rango de longitudes de onda a aquellas que se utilizan en la técnica ELISA, la cual generalmente se realiza con longitudes de onda comprendidas entre los 400 y los 750 nm –nanómetros–. Algunos analizadores operan en el rango ultravioleta y pueden efectuar análisis entre los 340 y los 700 nm. El sistema óptico utilizado por muchos fabricantes utiliza la fibra óptica para llevar la luz hasta los pozos de la placa, donde se encuentra la muestra bajo análisis. La luz que atraviesa la muestra tiene un diámetro que varía entre 1 y 3 mm. Un sistema de detección recibe la energía lumínica, proveniente de la muestra, la amplifica, determina la absorbancia y, a través de un sistema de lectura, la convierte en datos que permiten interpretar el resultado de la prueba. También hay analizadores de ELISA que emplean sistemas lumínicos de doble haz. Las muestras del ensayo de ELISA se colocan en placas de diseño especial, las cuales disponen de un número definido de pozos o vasos, en los cuales se lleva a cabo el procedimiento o ensayo.

Son comunes las placas de 8 columnas por 12 filas, con un total de 96 pozos. También existen placas con un mayor número de pozos. Las hay de 384 pozos y la tendencia actual busca aumentar el número de pozos, y reducir la cantidad de reactivos y el volumen de las muestras requeridas. La ubicación de los sensores ópticos en el analizador de ELISA varía dependiendo de los fabricantes. Algunos los colocan sobre la placa portamuestras, mientras que otros los ponen directamente bajo los pozos de la placa.

En la actualidad, los analizadores de ELISA disponen de controles regulados por microprocesadores, interfases de conexión a sistemas de información, programas de control de procesos y control de calidad que, a través del computador, permiten la automatización completa de los ensayos requeridos.

Equipos requeridos para efectuar ensayos de ELISA

Para desarrollar la técnica de ELISA se requiere disponer al menos de los siguientes equipos:

1. Un analizador de ELISA.

2. Un lavador de ELISA (capítulo 2).

3. Un sistema dispensador de líquidos. (Pueden usarse pipetas multicanal).

4. Una incubadora especializada para las placas.

Conjunto de equipos para pruebas ELISA

Fases mecánicas de un ensayo utilizando la técnica de ELISA

Uso de equipos

Cuando se realiza una prueba de ELISA, generalmente se siguen estos pasos:

1. Utilizando el lavador de ELISA o microplacas, se efectúa un primer lavado de la placa.

2. Mediante el dispensador de líquidos o las pipetas multicanal, se llenan los vasos o pozos de las placas con las soluciones preparadas para ser utilizadas en el ensayo.

3. A continuación, se coloca la placa en la incubadora donde, a temperatura controlada, se lleva a cabo un conjunto de reacciones.

Las etapas 1, 2 y 3 se pueden repetir varias veces dependiendo del ensayo, hasta que se logre que las muestras colocadas en las placas hayan terminado sus reacciones.



4. Finalmente, cuando se han completado las reacciones químicas, se lleva la placa al analizador de ELISA y se efectúan las lecturas que permiten emitir un diagnóstico.

Fases químicas de la técnica de ELISA

Se presenta a continuación un breve resumen de cómo funciona la técnica de ELISA, desde el punto de vista químico

1. Se recubren los pozos de una placa con anticuerpos o antígenos.

2. Se añaden las muestras, controles y estándares a los pozos de la placa y se incuban a temperaturas que oscilan entre la temperatura ambiente y 37 °C, por un período de tiempo determinado, según características de la prueba. Durante la incubación, una parte del antígeno de la muestra se une al anticuerpo del recubrimiento de la placa, o el anticuerpo de la muestra se une con el antígeno ubicado en el recubrimiento de la placa, en función de su presencia y cantidad en la muestra analizada.

3. Después de la incubación, las entidades no unidas –antígenos o anticuerpos– se lavan y se retiran de la placa, utilizando el lavador de ELISA que utiliza un adecuado.

4. A continuación, se añade un anticuerpo secundario, denominado el cual tiene una enzima que reaccionará con un sustrato para producir un cambio de color.

5. Se inicia entonces un segundo período de incubación, durante el cual el conjugado se unirá al complejo antígeno-anticuerpo en los pozos de la placa.

6. Después de la incubación, se realiza un nuevo lavado para retirar de los pozos de la placa cualquier vestigio del conjugado no unido.

7. Se añade un sustrato. La enzima reaccionará con el sustrato y causará un cambio de color en la solución, brindando un medio para medir la cantidad de conjugado que a la vez dirá cuánto complejo antígeno- anticuerpo está presente. Otro período de incubación permitirá que esta reacción tenga lugar.

8. Cumplido el tiempo de incubación, se añade un reactivo para detener la reacción sustrato-enzima y prevenir cambios adicionales de color. Generalmente este reactivo es un ácido diluido.

9. Finalmente, se efectúa la lectura de la placa en el analizador de ELISA. Los valores de los resultados se usan para determinar las cantidades de antígeno o anticuerpo específicos presentes en la muestra.

Algunos de los pozos en la placa se destinan para colocar estándares y controles. Los estándares permiten definir los puntos de corte (Los controles son cantidades conocidas que se usan para medir el éxito del ensayo, evaluando los datos recibidos contra las concentraciones establecidas para cada control. El proceso antes descrito es común, aunque muchas pruebas de ELISA tienen variantes.

1.buffer de lavadoconjugado, elcut off).

SERVICIOS REQUERIDOS

Para que el analizador de ELISA opere correctamente, es necesario verificar los siguientes puntos:

1. Un ambiente limpio, libre de polvo.

2. Una mesa de trabajo estable. Lo recomendable es que la misma esté alejada de equipos que generen vibraciones –centrífugas, agitadores–, que tenga un tamaño adecuado que permita ubicar, al lado del analizador de ELISA, los equipos complementarios requeridos para efectuar la técnica en mención: lavadores, incubadora, dispensador y computador con periféricos.

3. Una fuente de suministro eléctrico de acuerdo con las normas y estándares implementados en el país. En los países americanos se  utilizan por lo general voltajes de 110 V y frecuencias de 60 Hz.

 

Calibración del analizador de ELISA

 

La calibración de un analizador de ELISA es un proceso especializado que debe realizar

un técnico o ingeniero debidamente entrenado, siguiendo las instrucciones que para el efecto brinda cada fabricante. Para efectuar la calibración se requiere disponer de un juego de filtros grises, los cuales se encuentran montados en una placa de igual geometría a las utilizadas para efectuar los análisis. Los fabricantes suministran dichos filtros y pueden ser utilizados para realizar calibraciones a cualquier longitud de onda de las que utiliza el equipo.

Los filtros de calibración disponen de al menos tres valores de densidad óptica, reestablecidos dentro de los rangos de medición; uno bajo, uno medio y el último, un valor alto.

Para efectuar la calibración se realiza el siguiente proceso:

1. Colocar el filtro de calibración en el equipo.

2. Efectuar una lectura completa con el filtro de calibración. Verificar si se presentan diferencias en las lecturas obtenidas de canal a canal. Si es así, invertir el filtro (180°) y repetir nuevamente la lectura para descartar que las diferencias puedan ser atribuibles al filtro en sí. Por lo general, se acepta que el instrumento no requiere calibración, si se encuentra ajustado en dos longitudes de onda.

3. Verificar si el lector está descalibrado. Si es así, proceder a la calibración, siguiendo la rutina definida por el fabricante, verificando especialmente que la linealidad de las lecturas se mantenga lo más rigurosamente posible.

4. Si no se dispone de filtro de calibración, verificar la misma colocando una solución de color en los pozos de una placa y efectuando en seguida una lectura completa.

Luego invertir la placa 180° y efectuar una nueva lectura. Si ambas lecturas presentan valores promedio idénticos en cada fila, el analizador se encuentra calibrado.

5. Verificar si el desplazamiento de la placa se encuentra calibrado, columna por columna.

Colocar una placa vacía y efectuar las lecturas.

Si no se observan diferencias medias entre las lecturas de columna a columna de la

primera a la última, podría asumirse que el avance se encuentra calibrado.

 

RUTINAS DE MANTENIMIENTO

Las rutinas que se describen a continuación están enfocadas exclusivamente al analizador de ELISA. El mantenimiento del lavador de ELISA está tratado en el capítulo correspondiente.

 

Mantenimiento básico

 

Frecuencia: Diaria

 

1. Revisar que los sensores ópticos de cada canal estén limpios. Si se detecta suciedad, limpiar con un pincel la superficie de las ventanas de los emisores de luz y de los sensores.

2. Confirmar que el sistema de iluminación esté limpio.

3. Verificar que la calibración del analizador es adecuada. Cuando se inicien las operaciones diarias, permitir que el analizador se caliente durante 30 minutos. A continuación, realizar una lectura en blanco y luego leer un módulo lleno de sustrato.

Las lecturas deben ser idénticas. Si no lo son, invertir el módulo y repetir la lectura, a fin de determinar si la desviación se origina en el módulo o en el lector.

4. Examinar el avance automático de la placa.

El mismo debe ser suave y constante.

 

Mantenimiento preventivo

 

Frecuencia: Trimestral

 

1. Verificar la estabilidad de la lámpara. Usar el filtro de calibración, efectuando lecturas con intervalos de 30 minutos o una misma placa. Comparar las lecturas. No deben existir diferencias.

2. Limpiar los sistemas ópticos de los detectores y los sistemas de iluminación.

3. Limpiar el mecanismo de avance de la placa.

4. Verificar la alineación de cada pozo con los sistemas emisores y detectores de luz.

 

 

DEFINICIONES BÁSICAS ELISA.

 

Técnica desarrollada para efectuar análisis que permiten determinar si una sustancia se encuentra presente en una muestra.

Se utiliza principalmente en el área de inmunología.

La palabra ELISA es el acrónimo de las palabras en lengua inglesa Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.

Enzima. Proteína que sirve de catalizador en una reacción química, acelerando las reacciones.

Fluoróforo. Moléculas que absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten luz de una longitud de onda mayor.

Lavador de ELISA. Equipo que se utiliza para lavar las placas durante las etapas de una prueba de ELISA, con el fin de remover aquellos componentes que no se han unido en las

reacciones. El lavador de ELISA utiliza buffers especiales en los procesos de lavado.

Lector de microplacas. Nombre dado a los analizadores de ELISA.

Placa de ELISA. Elemento de consumo que se ha estandarizado para efectuar los análisis mediante la técnica de ELISA. Las placas tienen en general 96 pozos en una configuración típica de 8 filas por 12 columnas. También hay placas de ELISA de 384 y recientemente se han venido imponiendo microplacas de hasta 1 536 pozos, en centros de alta demanda, debido a las economías logradas en insumos y reactivos.

Quimioluminiscencia. Emisión de luz que aparece durante una reacción química.

TMB. Sustrato usado con la enzima HRP.

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